1 儀器與試藥
HPLC液相色譜儀; SPD-UV 檢測器。膽酸對照品( 批號100078-200414) 、豬去氧膽酸對照品( 批號100087-200610; 標(biāo)示純度為:97. 3%) 均由中國藥品生物制品檢定所提供; 膽酸、豬去氧膽酸各10 批; 乙腈為色譜純; 其余試劑均為分析純。2 方法與結(jié)果
2. 1 色譜條件
色譜柱: Diamonsil-C18( 4. 6 mm × 150 mm，5μm) ; 流動相: 乙腈-水-磷酸( 35 ∶ 65 ∶ 0. 1) ; 檢測波長: 192 nm; 柱溫: 25 ℃; 流速: 1. 5 mL·min － 1。色譜圖見圖1。
圖1 HPLC 圖譜
A. 膽酸對照品; B. 豬去氧膽酸對照品; C. 膽酸供試品; D. 豬去氧膽酸供試品
2. 2 溶液制備
2. 2. 1 對照品溶液制備
精密稱取膽酸對照品15. 77 mg，置于10 mL 量瓶中，加60% 乙腈制成每1 mL含膽酸1. 577 mg 的對照品溶液; 再精密稱取豬去氧膽酸對照品9. 90 mg，同法制成每1 mL 含豬去氧膽酸0. 963 3 mg 的對照品溶液，即得。
2. 2. 2 供試品溶液制備
精密稱取膽酸、豬去氧膽酸各10 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加60%乙腈使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
2. 3 方法學(xué)考察
2. 3. 1 線性
分別精密量取膽酸和豬去氧膽酸對照品溶液各2，5， 10， 15， 20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積值。以膽酸和豬去氧膽酸各自的對照品進(jìn)樣量( μg) 和峰面積值進(jìn)行回歸處理，回歸方程分別為，膽酸: y = 12 504x + 917. 37，r = 0. 999 5; 豬去氧膽酸: y = 7 995. 4x + 41. 437，r = 0. 999 2，膽酸的線性關(guān)系范圍為: 3. 154 ～ 31. 540 μg; 豬去氧膽酸的線性關(guān)系范圍為: 1. 927 ～ 19. 266 μg。
2. 3. 2 zui低檢測限
分別取膽酸和豬去氧膽酸對照品溶液，用60%乙腈稀釋30 倍，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定信噪比( S /N) = 3，故膽酸、豬去氧膽酸的zui低檢測限分別為0. 5 和0. 3 μg。
2. 3. 3 精密度
分別取膽酸和豬去氧膽酸對照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10( L，連續(xù)6 次。結(jié)果膽酸RSD 為0. 29%; 豬去氧膽酸RSD 為0. 65%。
2. 3. 4 重復(fù)性
取膽酸( 批號B1-09-05-02) 和豬去氧膽酸( 批號B2-09-05-01) 樣品，照“2. 2. 2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別平行試驗(yàn)6 份，測定膽酸和豬去氧膽酸的含量。結(jié)果膽酸RSD 為0. 71%; 豬去氧膽酸RSD 為0. 81%。
2. 3. 5 穩(wěn)定性
取膽酸( 批號B1-09-05-02) 和豬去氧膽酸( 批號B2-09-05-01) 樣品，照“2. 2. 2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，6，8 h 進(jìn)樣10μL，測定峰面積值。結(jié)果膽酸RSD 為0. 56%; 豬去氧膽酸RSD 為1. 4%。
2. 3. 6 加樣回收率試驗(yàn)
精密稱取膽酸供試品( 批號B1-09-05-02，含量: 83. 4%) 適量( 約相當(dāng)于膽酸含量為10 mg) 、豬去氧膽酸供試品( 批號B2-09-05-01，含量為73. 0%) 適量( 約相當(dāng)于豬去氧膽酸含量為8 mg) ，分別置于10 mL 量瓶中，加60%乙腈使溶解并稀釋至刻度。再精密量取膽酸對照品溶液( 濃度為5. 006mg·mL － 1 ) 、豬去氧膽酸對照品溶液( 濃度為3. 988 mg·mL － 1 ) 各2 mL，分別加入上述膽酸、豬去氧膽酸供試品溶液中，混勻即得。分別平行試驗(yàn)6 份，測定含量。結(jié)果膽酸回收率為:98. 98%，RSD 為0. 42%; 豬去氧膽酸回收率為:98. 29%，RSD 為0. 61%，結(jié)果見表1，2。
2. 4 樣品含量測定
取膽酸和豬去氧膽酸樣品，照“2. 2. 2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10( L，測定膽酸和豬去氧膽酸的含量。結(jié)果見表3，4。
3 討論
膽酸現(xiàn)有藥品標(biāo)準(zhǔn)系采用紫外分光光度法進(jìn)行含量測定，豬去氧膽酸則是采用酸堿滴定法測定含量，以上兩種方法存在操作繁瑣、準(zhǔn)確度差、專屬性差等缺點(diǎn)，本文應(yīng)用HPLC-UV 法檢測膽酸及豬去氧膽酸含量，方法簡便、準(zhǔn)確，可以實(shí)現(xiàn)對兩種成分的快速定量分析。文中供試品的制備方法及色譜條件主要參照《中國藥典》2005年版一部“清開靈注射液”項(xiàng)下膽酸的含量測定方法。
膽酸和豬去氧膽酸均為紫外末端吸收( 192nm) ，靈敏度方面較蒸發(fā)光散射檢測器稍為遜色，但考慮到HPLC-ELSD 儀器較昂貴，適用性不強(qiáng)，因此在常規(guī)質(zhì)量分析中，HPLC-UV 法更為實(shí)用。
膽酸的含量范圍按標(biāo)準(zhǔn)不得少于80. 0%，通過以上10 批樣品的檢測結(jié)果可以看出，本標(biāo)準(zhǔn)適用于液相色譜法; 而豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)含量為不得少于98. 0%( 酸堿滴定法) ，由于酸堿滴定法所檢測成分的專屬性差，能與NaOH 發(fā)生反應(yīng)的酸性物質(zhì)均會被檢測出來，因此應(yīng)用液相色譜法測定豬去氧膽酸含量通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于滴定法，根據(jù)以上對10 批樣品的實(shí)際檢測情況，可擬訂豬去氧膽酸含量范圍為: 本品按干燥品計(jì)算，含豬去氧膽酸( C24H40O4) 不得少于70. 0%。以上標(biāo)準(zhǔn)可以作為膽酸及豬去氧膽酸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
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